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作者：香雪生命科學(xué)-王秋玲
發(fā)布時(shí)間：2023-04-17
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近年來(lái)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在生物大分子研究上得到了廣泛的應用，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的支撐技術(shù)之一。我們香雪生命科學(xué)研究中心目前就擁有兩套先進(jìn)的液質(zhì)聯(lián)用系統，分別是Eksigent NanoLC與SCIEX Triple TOF 5600+聯(lián)用、DIONEX NanoLC U3000與Thermo Q-Exactive Plus聯(lián)用，這兩套液質(zhì)系統在TCR-T細胞治療的研發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)舉足輕重的作用，它們幫助我們發(fā)現了大量的文獻報導過(guò)或未報導過(guò)的抗原肽，為T(mén)CR-T細胞治療的研發(fā)提供了豐富的靶點(diǎn)；另一方面，這兩套液質(zhì)系統如同研究者的眼睛，對樣品進(jìn)行精準的分析，為T(mén)CR-T細胞治療的研發(fā)提供了質(zhì)量保障。
圖1 香雪生命科學(xué)實(shí)驗室的兩套液質(zhì)聯(lián)用系統
但是你知道它們是怎么工作的嗎？現在讓我們一起來(lái)學(xué)習液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的基本原理。
液質(zhì)聯(lián)用，顧名思義就是液相色譜（LC）和質(zhì)譜（MS）的聯(lián)用，液相色譜將待測樣品中的有機物成分有效分離，質(zhì)譜負責對這些分開(kāi)的有機物進(jìn)行檢測鑒定，兩者的有效結合能夠對復雜樣品進(jìn)行準確的定性和定量分析。舉個(gè)例子，樣品相當于廣場(chǎng)上成千上萬(wàn)的人群，色譜把人群按照一定的規則（比如按身高或年齡之類(lèi)）排成隊伍走出廣場(chǎng)，質(zhì)譜在廣場(chǎng)出口對人員信息進(jìn)行一一識別，這樣就可以準確地收集大量人員的信息。
一、液相色譜
1.1液相色譜的基本原理
首先我們來(lái)認識一下色譜。1906年，俄國的植物學(xué)家Tsweet利用碳酸鈣作為基質(zhì)，石油醚作為流動(dòng)相成功分離了葉綠素和胡蘿卜素。它們分離后呈現出不同顏色的條帶，因此Tsweet把這種分離技術(shù)取名為色譜。這里色素的分離就是利用了柱子上的碳酸鈣對色素的吸附作用力強弱不同，導致色素在柱子里的流動(dòng)速度也不一樣，從而達到分離的效果。所以，色譜分離的原理就是利用待分離物質(zhì)在固定相（比如前面提到的碳酸鈣）和流動(dòng)相（比如用來(lái)沖洗色素的石油醚）之間相互作用的差異來(lái)實(shí)現物質(zhì)的分離。
高效液相色譜是以經(jīng)典的液相色譜為基礎，由分離系統、流動(dòng)相輸送系統、進(jìn)樣系統、檢測系統等幾個(gè)模塊構成。以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統將單一溶劑或不同比例的混合溶劑等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，各成分在柱內被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測。相對Tsweet的色譜分離模型，高效液相色譜具有更高的分離效率和靈敏度，自動(dòng)化高，重現性好。
1.2 納升級液相色譜
對于微量且復雜的蛋白質(zhì)分析，高效液相色譜的靈敏度還不夠，目前常用納升級液相色譜（Nano-LC），比如我們香雪生命科學(xué)實(shí)驗室中的Eksigent NanoLC和DIONEX NanoLC U3000。納升級液相色譜主要以縮小色譜柱內徑和降低流速來(lái)提高檢測的靈敏度。以常規高效液相色譜常用的4.6mm內徑的色譜柱和1mL/min的流速為例來(lái)對比，納升級液相色譜如使用75μm內徑色譜柱、300nL/min的流速，相當于色譜柱內徑縮小了約61倍，流速降低了約3300倍。這意味著(zhù)進(jìn)相同樣品量，納升級液相色譜中樣品被流動(dòng)相稀釋后的理論濃度是常規高效液相色譜的約3000倍，從而提高了檢測的靈敏度。相應地，納升級液相色譜要求樣品應濃縮到相對小的體積再進(jìn)樣，但這不易實(shí)現。目前納升級液相色譜普遍采用增加Trap柱系統的方法，樣品先進(jìn)入Trap柱富集肽段，用高水相和高流速（2-5μL/min）沖洗，除去樣品中的鹽和其它雜質(zhì)后，再將Trap柱與分析柱相連，樣品經(jīng)流動(dòng)相洗脫進(jìn)入分析柱。樣品經(jīng)過(guò)分析柱后就可以引入到質(zhì)譜檢測。
二、質(zhì)譜
顧名思義，質(zhì)譜儀就是檢測質(zhì)量的儀器，將待測樣品分子離子化形成帶電離子，利用電場(chǎng)或磁場(chǎng)將運動(dòng)的離子按質(zhì)荷比（m/z）分離并被檢測。我們可以根據各離子的質(zhì)荷比及其相對強度來(lái)鑒定化合物分子組成和相對濃度。
既然是根據離子的質(zhì)量來(lái)推測化合物分子組成，不得不先認識評估質(zhì)譜的兩個(gè)重要參數：分辨率和準確度。分辨率：是指質(zhì)譜儀區分兩個(gè)質(zhì)量相近的離子的能力。準確度：指質(zhì)譜儀對指定質(zhì)量數離子測量值與理論值之間的偏差，單位ppm。分辨率越高，質(zhì)量偏差越小，理論化合物范圍也越窄，可大大提高鑒定的準確度。目前高分辨質(zhì)譜儀準確度可達到2-5ppm。
2.1質(zhì)譜的基本構成
接著(zhù)，我們來(lái)認識一下質(zhì)譜的構成。質(zhì)譜大體構造是基本相同的，主要分成以下幾個(gè)部分：真空系統、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器及數據處理系統。
圖2 質(zhì)譜構成的示意圖
真空系統：質(zhì)譜為什么需要真空系統？假設沒(méi)有真空，離子碎片經(jīng)過(guò)質(zhì)量分析器時(shí)，可能會(huì )碰到氧氣、氮氣等氣體分子，它的運行軌道就會(huì )發(fā)生變化，還可能失去電荷。所以，需要保證質(zhì)譜的真空狀態(tài)，為離子提供一個(gè)足夠長(cháng)的無(wú)碰撞運行軌道。
離子源：主要作用是將液相的化合物分子氣化電離成帶電荷的離子，因為只有帶電荷的離子才可以在質(zhì)譜儀的場(chǎng)中運動(dòng)，是銜接色譜與質(zhì)譜的關(guān)鍵。電噴霧離子源可形成多電荷離子，適合分析蛋白質(zhì)、肽等生物大分子。離子化過(guò)程簡(jiǎn)單歸納為：高壓電場(chǎng)作用下，液體樣品流至噴嘴時(shí)形成泰勒錐，產(chǎn)生帶電荷的微液滴，液滴上的溶劑蒸發(fā)，表面電荷密度過(guò)大，使液滴分裂成更小液滴，多次分裂后形成氣態(tài)離子。
質(zhì)量分析器和檢測器：質(zhì)量分析器是質(zhì)譜的核心模塊，利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將帶電荷的離子按質(zhì)荷比m/z的大小分開(kāi)，下面會(huì )具體介紹；檢測器對分離后的離子及其強度進(jìn)行讀取。
2.2 質(zhì)量分析器的類(lèi)型及基本原理
目前常用的質(zhì)量分析器按分離方式主要有四極桿（Quadrupole，Q）、飛行時(shí)間（TOF）、離子阱（ion trap）、軌道阱（Orbitrap）等。
四極桿：四極桿分析器是由四根導電桿組成，四個(gè)桿分別位于正方形的四個(gè)角。質(zhì)譜儀通過(guò)在四級桿施加RF和DC電壓來(lái)控制離子的運動(dòng)，通過(guò)電壓的變化，四級桿形成的電場(chǎng)可以讓不同質(zhì)荷比的離子通過(guò)。四級桿具有過(guò)濾離子的功能。四極桿分析器分辨率較低，準確度不高，但穩定性好，定量能力強。
飛行時(shí)間（TOF）：飛行時(shí)間分析器像一個(gè)離子漂移管。由離子源產(chǎn)生的離子先被收集，收集器中所有離子速度變?yōu)?。離子經(jīng)過(guò)電場(chǎng)加速區域獲得相同的初始動(dòng)能后，進(jìn)入沒(méi)有電場(chǎng)區域以恒定的速度飛向離子接收器。由于所有離子的初始動(dòng)能相同，重的離子飛行速度慢一些，輕的離子飛得快，不同m/z的離子到達檢測器的時(shí)間不同，根據時(shí)間來(lái)計算離子的質(zhì)荷比。TOF具有最快的掃描速度和最寬的分子量檢測范圍。
圖3 四類(lèi)質(zhì)量分析器示意圖
離子阱（ion trap）：線(xiàn)性離子阱分析器橫截面比較類(lèi)似于四極桿，在電流電壓下可使離子一直保持在離子阱中心運動(dòng)，通過(guò)調節電流電壓，特定離子會(huì )被彈射出來(lái)用于后續的碎裂和質(zhì)量分析。離子阱同樣具備特定離子的選擇過(guò)濾功能。離子阱適合于分子結構方面的定性研究，能夠給出分子局部的結構信息。
軌道阱（Orbitrap）：軌道阱分析器由一對外半電極圍繞的紡錘形中心電極組成。運動(dòng)的離子被靜電場(chǎng)捕獲，在靜電引力和離心力雙重作用下，離子圍繞中心紡錘形電極做螺旋模式運動(dòng)，不同質(zhì)荷比的離子以不同的頻率振蕩，通過(guò)傅立葉變換轉化讀取離子的m/z信息。Orbitrap具有較高的分辨率。
根據分離原理和作用的不同，可以將上面的質(zhì)量分析器分為兩大類(lèi)：一類(lèi)為質(zhì)量檢測型，可測定進(jìn)入質(zhì)譜儀的不同質(zhì)荷比離子的豐度，但不能選擇離子通過(guò)質(zhì)譜儀，比如TOF和Orbitrap等；另外一類(lèi)是質(zhì)量過(guò)濾型，可讓特定質(zhì)荷比或質(zhì)荷比區段的離子通過(guò)質(zhì)譜儀，比如四級桿和離子阱。
2.3串聯(lián)質(zhì)譜
液質(zhì)聯(lián)用主要采用軟電離的離子化方式，通常很少或沒(méi)有碎片，如果只采用單個(gè)質(zhì)量分析器，譜圖中只有準分子離子，只能提供未知化合物的分子量信息，不能提供更多結構信息，未能體現較好的鑒定能力。為了解決這方面的問(wèn)題，通常利用串聯(lián)質(zhì)譜來(lái)實(shí)現這個(gè)需求。
目前最常用的串聯(lián)質(zhì)譜是三重四級桿（Triple Quadrupole），在兩個(gè)四級桿間加一個(gè)碰撞池進(jìn)行串聯(lián)。它在保留原有定量能力強的特點(diǎn)上，串聯(lián)功能加強了質(zhì)譜的定性能力和檢測靈敏度。三重四級桿靈敏度高、特異性強，適用于小分子檢測，在食品、環(huán)保、制藥和司法鑒定領(lǐng)域應用成熟，在臨床診斷的生化、免疫、分子等領(lǐng)域對傳統方法學(xué)正在進(jìn)行替代。
蛋白質(zhì)組學(xué)分析具有成分復雜且含量低的特點(diǎn)，采用質(zhì)量過(guò)濾型分析器與高分辨率質(zhì)量分析器串聯(lián)的方法比較常見(jiàn)。比如我們香雪生命科學(xué)實(shí)驗室的SCIEX Triple TOF 5600+采用了四級桿和TOF串聯(lián)串聯(lián)，Thermo Q-Exactive Plus采用四級桿和Orbitrap組合。它們的串聯(lián)方式與三重四級桿類(lèi)似：四級桿+碰撞室+TOF或者Orbitrap。
圖4 Thermo Q-Exactive Plus的結構示意圖
質(zhì)譜的串聯(lián)方式有很多，但無(wú)論哪種串聯(lián)，都必須有碰撞活化室，二級譜圖檢測過(guò)程大致如圖所示：從第一級MS選定的特定質(zhì)荷比離子，經(jīng)過(guò)碰撞誘導裂解形成一些碎片，再經(jīng)過(guò)第二級MS進(jìn)行質(zhì)量分析，獲得碎片離子峰。通過(guò)對碎片的化學(xué)結構進(jìn)行分析和拼裝，來(lái)實(shí)現對化合物的結構鑒定。
圖5 串聯(lián)質(zhì)譜示意圖
具體到對肽段序列的檢測分析，肽段在質(zhì)譜中的碎裂有一定的規律，肽段母離子在質(zhì)譜儀的碰撞室經(jīng)高流速氣體碰撞誘導解離，其中以肽鏈在肽鍵中間裂解形成的b型和y型子離子在質(zhì)譜圖中豐度較高。b型離子保留肽鏈N端，y型離子離子保留肽鏈C端。y、b系列相鄰離子的質(zhì)量差，即為氨基酸殘基質(zhì)量，根據完整或互補的b、y系列離子可推算出肽段的序列。
經(jīng)過(guò)上面分別對液相色譜和質(zhì)譜的簡(jiǎn)單介紹，您對液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)有了初步的認識了吧？
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