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作者：香雪生命科學(xué)-孫含麗
發(fā)布時(shí)間：2022-07-26
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mRNA于20世紀60年代初被首次發(fā)現，是連接基因和蛋白質(zhì)的橋梁。全球肆虐的新冠疫情使mRNA成為備受矚目的研究領(lǐng)域，加速了mRNA技術(shù)的普及和商業(yè)化，促使美國FDA于2021年8月23日和2022年1月31日完全批準了兩款mRNA新冠疫苗，分別是輝瑞/BioNTech合作開(kāi)發(fā)的Comirnaty（BNT162b2）與Moderna公司開(kāi)發(fā)的Spikevax（mRNA-1273）。這兩款疫苗此前分別已于2020年12月2日和2020年12月17日獲得緊急使用授權。
傳統的疫苗工藝依賴(lài)于生物反應裝置或在雞胚中使用哺乳動(dòng)物細胞批量生產(chǎn)疫苗，而mRNA疫苗只需在接種者體內經(jīng)過(guò)一次轉化就可以發(fā)揮作用。可以說(shuō)mRNA是利用人體作為“生物反應裝置”，這一過(guò)程具有以下幾項優(yōu)勢：
首先，mRNA允許人體對編碼蛋白進(jìn)行翻譯后修飾（PTM），這種蛋白免疫原性低、可完全發(fā)揮作用。其次，在生物反應器中不能產(chǎn)生的多聚體蛋白可以在接種者細胞內完成正確的翻譯、折疊和組裝。此外，mRNA療法可以產(chǎn)生跨膜蛋白和細胞內蛋白，并可在細胞中將這些蛋白轉運到適當的位置發(fā)揮作用。
圖1 mRNA技術(shù)發(fā)展歷程
從發(fā)展歷程來(lái)看，mRNA從發(fā)現到首個(gè)產(chǎn)品上市用了接近60年的時(shí)間， 直到2020年mRNA新冠疫苗問(wèn)世，mRNA技術(shù)才迎來(lái)應用方面的快速發(fā)展。mRNA技術(shù)三巨頭（Moderna、BioNTech和CureVac）于2019年前后上市，我國mRNA技術(shù)行業(yè)在此階段也開(kāi)始蓬勃發(fā)展。mRNA技術(shù)商業(yè)化應用主要有兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要解決: 一是mRNA的結構穩定性，二是將mRNA遞送至靶細胞的遞送系統。這兩個(gè)問(wèn)題一直是困擾行業(yè)發(fā)展的瓶頸，直到2015～2019年，LNP（Lipid nanoparticle）遞送技術(shù)及核酸序列修飾技術(shù)的逐漸成熟，才給mRNA行業(yè)發(fā)展帶來(lái)充足動(dòng)力。現階段商業(yè)化應用的mRNA序列由5部分組成：5’帽子結構 （5’Cap）、5’非翻譯區（5’UTR）、開(kāi)放閱讀框（ORF）、3’非翻譯區（3’UTR）、3’Poly(A)尾巴。
圖2 mRNA結構[2]
mRNA分子本身不穩定，提高mRNA穩定性的技術(shù)包括優(yōu)化5’Cap、調整3’Poly(A)尾長(cháng)度以及修飾5’UTR和3’UTR中的調控元件。此外，將mRNA遞送到細胞內部有兩道屏障：遞送途中的酶降解和靜電排斥致使的膜屏障。需要特殊的修飾或遞送系統才能實(shí)現mRNA的胞內表達。目前常用的mRNA遞送系統如下：
脂質(zhì)納米粒LNP：是當前主流遞送系統，采用此遞送系統的公司有mRNA三巨頭Moderna、BioNTech、 CureVac，此外還有Arcturus、 Valera LLC、 艾博、 珠海麗凡達、 深圳深信等
聚合物納米粒PNP：代表公司為圣諾、達冕
脂質(zhì)多聚復合物L(fēng)PP：代表公司為斯微
GalNac：代表公司為蘇州瑞博
陽(yáng)離子脂質(zhì)復合物L(fēng)PX：代表公司為艾博、BioNTech
此外還有電穿孔EP、無(wú)機納米粒INP、陽(yáng)離子納米乳CNE等
簡(jiǎn)單介紹一下LNP遞送系統，LNP與mRNA形成脂質(zhì)納米顆粒，主要由以下五部分構成：
mRNA：有效成分
可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)：與帶負電的mRNA結合，可高效包載核酸藥物，具有pH敏感性，生理條件下（pH=7.4）不電離，酸性條件下（≤5.0）發(fā)生電離，是mRNA遞送和轉染效率的決定性因素
中性輔助脂質(zhì)：可提高陽(yáng)離子脂質(zhì)體的相變溫度，支持層狀脂質(zhì)雙層結構的形成并穩定其結構排列
膽固醇：穩定納米粒結構，有較強的膜融合性，促進(jìn)mRNA進(jìn)入胞質(zhì)
PEG修飾脂質(zhì)：位于脂質(zhì)納米粒表面，改善其親水性，避免被免疫系統快速清除（延長(cháng)半衰期），防止顆粒聚集，增加穩定性
圖3 LNP-mRNA結構(來(lái)源于Vaccines)
mRNA疫苗的作用原理：注射的mRNA疫苗被抗原呈遞細胞內吞，在逃離胞內體進(jìn)入胞漿后，mRNA被核糖體翻譯成蛋白質(zhì)，翻譯后的蛋白可以通過(guò)多種方式刺激免疫系統，激起人體的細胞免疫和體液免疫。
圖4 mRNA疫苗作用原理[2]
本篇接下來(lái)重點(diǎn)從mRNA的技術(shù)特點(diǎn)、mRNA技術(shù)的應用領(lǐng)域、mRNA技術(shù)的優(yōu)勢與改進(jìn)空間三個(gè)方面詳細介紹。
一、mRNA技術(shù)特點(diǎn)
1.1.安全性高
mRNA疫苗沒(méi)有減毒活疫苗"毒力返祖"或在部分個(gè)體中誘發(fā)嚴重疾病的可能。與DNA疫苗和某些病毒載體疫苗相比，mRNA疫苗不會(huì )整合到接種人群DNA中引發(fā)插入突變風(fēng)險。
1.2.研發(fā)周期短
新冠疫情在全球的大流行突顯了疫苗技術(shù)快速應用于人體試驗的重要性和緊迫性。相對于傳統疫苗的開(kāi)發(fā)周期，目前獲批的兩款mRNA新冠疫苗的開(kāi)發(fā)時(shí)間縮短了11個(gè)月到幾年不等。
1.3.規模化生產(chǎn)效率高
由于mRNA疫苗體內發(fā)揮作用不依賴(lài)活病毒，因此無(wú)需專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗設備與生物安全實(shí)驗室。在生產(chǎn)過(guò)程中，無(wú)需培養活的細胞，不存在細菌污染的風(fēng)險。組成mRNA疫苗的基本化學(xué)成分相同，因此，建立了一條mRNA疫苗生產(chǎn)線(xiàn)后，可以對新出現的或季節性的流行病做出快速反應。
1.4.快速的抗原特異性序列優(yōu)化
mRNA技術(shù)的另一項優(yōu)勢在于可以通過(guò)改變核酸序列來(lái)不斷優(yōu)化編碼抗原，相對于制備不同蛋白或多肽的生物工程技術(shù)，這一過(guò)程相對更加簡(jiǎn)單直接。
1.5.可以編碼多種蛋白或蛋白亞基
對于免疫原由多個(gè)不同亞基組成的病原體，生產(chǎn)多個(gè)亞基并按照化學(xué)計量學(xué)組成，成功的完成重組并構成完整蛋白的免疫原，其中的挑戰不言而喻。而mRNA可以輕松地完成上述步驟。
1.6.調節mRNA免疫原性
除了通過(guò)改變mRNA序列優(yōu)化抗原免疫原性之外，mRNA本身以及在mRNA制造過(guò)程中的其他RNA產(chǎn)物的固有免疫都可以用于增強免疫應答。目前，調節mRNA免疫原性主要的方法是核苷酸化學(xué)修飾。
1.7.遞送mRNA的納米制劑
目前，絕大多數mRNA藥物都采用LNPs遞送。LNP制劑的組成可顯著(zhù)影響胞內遞送效率，決定遞送靶細胞的特異性并調控免疫原性。
1.8.貯藏與運輸
以?xún)龈煞鄣男问劫A存和運輸是mRNA藥物最常使用的方法。然而，在凍干過(guò)程中由結晶和真空脫水產(chǎn)生的應力可能會(huì )降低生物大分子或LNPs的穩定性，導致活性喪失。有報道指出，向制劑中加入某些冷凍保護劑（如海藻糖、蔗糖和甘露醇）可以維持特定處方的穩定性。
1.9.給藥方式
盡管目前獲批的新冠mRNA疫苗都選擇肌內注射，關(guān)于mRNA疫苗的最佳接種途徑還沒(méi)有達成共識。目前，BTN162b2、CVnCoV、ARCT021和mRNA-1273都選擇肌內注射；而來(lái)自倫敦帝國理工學(xué)院的研究人員則考慮通過(guò)吸入給藥實(shí)現mRNA疫苗的自我擴增。吸入或鼻滴疫苗可引發(fā)細胞和體液免疫，這種方式對包括新冠病毒在內的呼吸道傳染病防治中特別有效。然而，鼻腔內mRNA疫苗的研究目前仍停留在動(dòng)物模型階段。總的來(lái)說(shuō)，肌內接種仍是各種疾病mRNA疫苗最常用的給藥方式。
1.10.給藥方案
對于新冠疫情的全球防治而言，最理想的給藥方案是單次給藥，但當下還沒(méi)有達到這種程度。目前采取的策略是加強免疫，即間隔數周內接受至少2次注射。
1.11. mRNA疫苗的副作用
由于疫苗本身預防性、非治療性的特性，對傳染病疫苗需要較高的安全性與耐受性標準。疫苗局部注射疼痛、局部或全身炎癥（發(fā)熱、不適）是接種疫苗后最常見(jiàn)的不良反應。
二、mRNA的三大應用領(lǐng)域
mRNA理論上能夠表達任何蛋白質(zhì)，mRNA技術(shù)的應用領(lǐng)域非常廣泛，目前能夠應用的場(chǎng)景包括預防性mRNA疫苗，抗腫瘤mRNA疫苗及基于mRNA的蛋白免疫療法與細胞免疫療法。
1、預防性mRNA疫苗
mRNA新冠疫苗驗證了mRNA技術(shù)平臺在疫苗領(lǐng)域的適用性，BioNtech和Moderna研發(fā)的mRNA疫苗在真實(shí)世界中表現出了良好的安全性和較高的有效率，三期臨床試驗數據的有效性達到95%左右。兩款mRNA新冠疫苗正式獲批意味著(zhù)傳染病防治方面的劃時(shí)代進(jìn)步，接下來(lái)需要在其它傳染性疾病的防治方面做出驗證，圖5列舉了部分針對其他傳染病的mRNA疫苗管線(xiàn)：
圖5 針對其他傳染病的mRNA疫苗管線(xiàn)(來(lái)源于ClinicalTrials)
2、抗腫瘤mRNA疫苗
將mRNA用于腫瘤免疫療法的原理是利用mRNA編碼突變腫瘤抑制蛋白，修飾腫瘤微環(huán)境，從而實(shí)現治療目的。該方法的應用受限于mRNA遞送技術(shù)。按照目前的遞送能力，mRNA無(wú)法到達患者體內的每一個(gè)腫瘤細胞。因此，研發(fā)人員越來(lái)越關(guān)注將mRNA作為治療性疫苗，誘導免疫系統識別并殺傷腫瘤細胞。
治療性疫苗的開(kāi)發(fā)過(guò)程有一系列常見(jiàn)的挑戰。首先，傳染病疫苗通過(guò)誘導機體體液免疫實(shí)現預防功能，而治療性腫瘤疫苗還必須能夠誘導強烈的CD8+T細胞反應以徹底根除所有腫瘤細胞。其次，開(kāi)發(fā)腫瘤治療性mRNA疫苗需要在體內編碼能夠誘導腫瘤高度特異性免疫反應的抗原。由于個(gè)體間抗原存在高度變異性，研究人員開(kāi)發(fā)了一系列患者特異性的新抗原以應對這一挑戰。最后，即便抗原能夠誘導細胞免疫反應，抑制性腫瘤微環(huán)境可阻礙T細胞浸潤腫瘤組織，甚至可能導致T細胞衰竭，因此治療性疫苗還需要與克服抑制性腫瘤微環(huán)境藥物（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）聯(lián)合使用。
圖6 mRNA三巨頭布局的腫瘤疫苗管線(xiàn)(來(lái)源于ClinicalTrials)
3、蛋白免疫療法與細胞免疫療法
mRNA的一個(gè)新興領(lǐng)域是體內編碼可用于治療的免疫蛋白或免疫調節蛋白，如抗體與細胞因子。與傳染病疫苗、腫瘤疫苗相比，這些療法需要產(chǎn)生更多的蛋白才可發(fā)揮作用，某些疾病甚至需要終身服藥。
蛋白免疫療法的一大挑戰是將mRNA遞送到所有目標器官和細胞中，實(shí)現最佳的治療效果。當mRNA以L(fǎng)NP為載體全身給藥時(shí)，由于載脂蛋白E可結合至LNP表面，LNP復合物將傾向于分布到肝臟組織，肝細胞表面受體將誘導LNP顆粒的肝細胞攝取。通過(guò)調整LNP中脂質(zhì)成分（包括調整脂質(zhì)比例和組成）可實(shí)現非肝臟的特異性組織分布，如肺組織內皮細胞或脾臟的靶向遞送。
因此，與疫苗相比，mRNA蛋白免疫療法在制劑遞送、蛋白生產(chǎn)有效性和耐受性方面提出了新的挑戰。這也可能是mRNA治療藥物比mRNA疫苗開(kāi)發(fā)進(jìn)度慢的原因。
3.1.mRNA編碼單抗療法
mRNA編碼直接在胞內產(chǎn)生抗體吸引了很多關(guān)注。例如，CureVac正和Cenmab合作開(kāi)展一項基于mRNA的mAb抗腫瘤療法。
3.2.mRNA編碼免疫刺激蛋白
另一種抗腫瘤的方法是注射可編碼具有直接治療效果蛋白的mRNA，編碼蛋白通過(guò)刺激免疫系統實(shí)現腫瘤殺傷作用。
3.3.過(guò)繼免疫細胞療法中的mRNA
過(guò)繼性免疫療法是一種相對較新的治療方法，這種方法從患者體內采集自身免疫細胞，體外處理后回輸到患者體內，達到治療腫瘤的目的。有研究表明，在乳腺癌瘤內注射轉染了編碼靶向c-Met的嵌合抗原受體（CAR）mRNA的T細胞，耐受性良好，可以在腫瘤組織中誘發(fā)免疫反應。
納米制劑幫助mRNA遞送至不同的免疫細胞，如巨噬細胞、B細胞和T細胞等，進(jìn)一步擴大了免疫療法的應用前景。例如， T細胞靶向遞送mRNA技術(shù)為體內生成CAR-T細胞創(chuàng )造了可能性，開(kāi)辟了腫瘤治療的新方式。
三、mRNA技術(shù)的優(yōu)勢與改進(jìn)空間
1、優(yōu)勢
mRNA在基因療法和蛋白療法中占據了獨特的地位，結合了兩種療法的優(yōu)勢，又規避了二者面臨的挑戰。例如，在生物反應器中生產(chǎn)多聚體蛋白難度很大，而這一挑戰可以通過(guò)單個(gè)mRNA或多種mRNA編碼蛋白不同亞基后，在患者體內自組裝解決。
給藥可重復、劑量可調整、給藥間隔可選擇的特性讓mRNA技術(shù)具有和經(jīng)典藥物治療一樣的靈活性，使其成為一個(gè)可適應患者個(gè)體需求的選擇。
通過(guò)對重組蛋白的研究，mRNA療法的潛力將進(jìn)一步擴大。例如，mRNA可編碼Fc結構域與治療結構域的融合蛋白，可有效延長(cháng)蛋白質(zhì)的體內半衰期。而更令人興奮的是將mRNA用于細胞療法。mRNA基因編輯的瞬時(shí)作用可以避免永久表達帶來(lái)的不良反應。
2、改進(jìn)空間
由于RNA可以通過(guò)TLR和RIG-1信號通路激活免疫系統，RNA的免疫刺激性對mRNA藥物具有非常重要的意義。這種免疫刺激性的缺點(diǎn)在于可能引發(fā)某些mRNA藥物的安全性與耐受性問(wèn)題。越來(lái)越多的證據表明，mRNA藥物最常見(jiàn)的副作用是某些炎癥反應。例如，在肌內注射或皮下注射時(shí)會(huì )出現疼痛、紅腫、酸脹的局部反應；在肌內注射或吸入藥物時(shí)可能出現發(fā)熱綜合征或流感樣反應。這些癥狀通常可以用抗炎藥處理，例如類(lèi)固醇給藥，但同時(shí)可能會(huì )降低蛋白表達水平。怎樣平衡炎癥反應和蛋白表達水平是一個(gè)問(wèn)題。
盡管在單次疫苗接種和用于治療腫瘤等危及生命的應用場(chǎng)景下，短暫的炎癥反應是可以接受的，但對于需要長(cháng)期治療的適應癥，尤其是通過(guò)靜脈注射的給藥方式，選擇具有良好耐受性和安全性的脂質(zhì)和其他輔料至關(guān)重要。
除即刻耐受性外，脂質(zhì)蓄積帶來(lái)的長(cháng)期問(wèn)題也需要考慮。若mRNA編碼的蛋白質(zhì)半衰期較短，則需要縮短給藥間隔以維持臨床療效所必須的蛋白表達量，這可能引發(fā)脂質(zhì)在靶組織和非靶組織中的蓄積，帶來(lái)健康風(fēng)險。mRNA的處方工藝將與mRNA生物學(xué)一道成為未來(lái)研發(fā)的重點(diǎn)。
mRNA的給藥途徑也很有想象空間，如肌內給藥、皮內給藥、皮下給藥、淋巴結注射、瘤內注射、靜脈注射、吸入給藥、鼻內疫苗、滴眼液或滴鼻液等。未來(lái)mRNA的治療領(lǐng)域將直接取決于納米藥物遞送技術(shù)的進(jìn)步。越來(lái)越多的證據表明，LNP和PNP可以實(shí)現機體組織靶向。而通過(guò)對遞送材料的改進(jìn)以及其他功能性材料的修飾，提高遞送系統的靶向性與遞送能力，mRNA的應用場(chǎng)景將進(jìn)一步拓寬。
mRNA技術(shù)在新冠疫苗當中的使用還暴露了另一個(gè)問(wèn)題：對冷鏈貯存與運輸的依賴(lài)。以Biotech的mRNA疫苗為例，其需要在-80℃貯存與運輸，不是所有藥房和臨床試驗基地都具備這樣的條件，對于患者在家中自行給藥就更加不可能普及。因此，提高mRNA藥物的穩定性對于擴大mRNA技術(shù)的應用領(lǐng)域至關(guān)重要。
參考資料：
[1]Ann J. Barbier et al. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 2022.
[2]Pharmaceutics 2020, 12(2), 102;
