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作者：香雪生命科學(xué)--盧華
發(fā)布時(shí)間：2021-04-29
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大家伙可能都聽(tīng)說(shuō)過(guò)，在2003年經(jīng)過(guò)多個(gè)國家的多年努力，完成了宏大的人類(lèi)基因組計劃，該工程通過(guò)測序確定了人類(lèi)染色體中30億個(gè)堿基對組成的DNA序列，被譽(yù)為生命科學(xué)研究的“登月計劃”。
對整個(gè)基因組（生物體中所有的DNA）進(jìn)行測序是一項復雜的任務(wù)。它需要將基因組DNA先分解成許多較小的片段，然后對這些小片段進(jìn)行測序，接著(zhù)將這些序列組裝成完整的DNA序列。 隨著(zhù)技術(shù)不斷發(fā)展和改進(jìn)，目前的全基因組測序速度更快，成本更低。本文給大家介紹經(jīng)典的測序方法——Sanger測序，然后簡(jiǎn)要介紹新一代測序技術(shù)
Sanger測序：鏈終止法
Sanger測序技術(shù)是由英國生物化學(xué)專(zhuān)家Sanger教授和其同事于1977年開(kāi)發(fā)，該方法測定的DNA片段一般不超過(guò)900個(gè)堿基。在人類(lèi)基因組計劃中，Sanger測序用于確定人類(lèi)DNA中許多相對較小片段的序列，但這些片段不一定小于900 個(gè)堿基，研究人員可以利用多輪Sanger測序沿著(zhù)每個(gè)片段進(jìn)行測序，再根據重疊部分對片段進(jìn)行比對，組裝較大DNA區域的序列，最終組裝整個(gè)染色體序列。
Sanger測序原理
Sanger測序涉及制備靶DNA區域的多個(gè)拷貝，它的組成類(lèi)似于生物體中復制DNA或體外復制DNA的聚合酶鏈反應（PCR）所需的成分：DNA聚合酶，引物，四種脫氧核苷酸（dNTP）以及待測序的DNA模板。
當然，Sanger測序反應也有其獨特的成分，這也是其核心原理：四種不同染料標記的雙脫氧核苷酸（ddNTP）。相比常規的脫氧核苷酸，雙脫氧核苷酸糖環(huán)的3’碳原子上缺少羥基。因此，在DNA合成過(guò)程中一旦雙脫氧核苷酸添加到鏈中，將無(wú)法正常形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而使DNA合成反應終止。該DNA鏈也就以染料標記的雙脫氧核苷酸結尾，可以利用凝膠電泳和顯影技術(shù)根據條帶位置確定待測DNA片段的序列。
圖一 Sanger測序
Sanger測序基本過(guò)程
在DNA合成反應體系中加入一定比例帶有染料標記的ddNTP，其數量要比普通核苷酸少得多。反應完成后，體系中包含了不同長(cháng)度的DNA片段，終止于待測DNA序列的每個(gè)核苷酸位置，并且片段的末端被帶有特定染料的ddNTP標記。
然后，將片段通過(guò)一根含有凝膠基質(zhì)的毛細管，該過(guò)程也稱(chēng)為凝膠電泳。短片段能夠快速地穿過(guò)凝膠，而長(cháng)片段相對移動(dòng)較慢。當每個(gè)片段越過(guò)管子末端時(shí)，都會(huì )被激發(fā)光照射，從而檢測出ddNTP上附著(zhù)的染料。
圖二 測序流程
最小的片段（在引物后僅插入了一個(gè)核苷酸）首先穿過(guò)終點(diǎn)線(xiàn)，然后是第二個(gè)最小的片段（在引物后插入了兩個(gè)核苷酸），依此類(lèi)推。因此，檢測器記錄的數據由一系列熒光強度峰組成，可以根據檢測器上一個(gè)接一個(gè)記錄的染料顏色，從色譜圖中讀取待測DNA的序列。
用途和局限性
Sanger測序可為較長(cháng)的DNA片段（最多約900個(gè)堿基對）提供高質(zhì)量的測定，主要用于對單個(gè)DNA片段進(jìn)行測序，如細菌生產(chǎn)的質(zhì)粒或者是PCR克隆的DNA。
但是，對于大型項目，如整個(gè)基因組或宏基因組（微生物菌群的“集體基因組”）測序，Sanger測序昂貴且效率低下。對于這類(lèi)任務(wù)，新的高通量測序技術(shù)更快，更便宜。
Next-generation sequencing
最新的DNA測序技術(shù)統稱(chēng)為下一代測序（NGS），也稱(chēng)高通量測序。有許多使用不同技術(shù)的新一代測序方法，但大多數具有相同的特點(diǎn)。相比傳統的Sanger測序，NGS支持多個(gè)測序反應同時(shí)進(jìn)行，測序反應體系小，可以在芯片上一次完成多組反應等優(yōu)點(diǎn)。但是，其測序長(cháng)度相對要短一些，通常為50-700個(gè)堿基。
從概念上講，下一代測序有點(diǎn)像同時(shí)運行大量微小的Sanger測序反應。由于這種并行化和小規模，與Sanger測序相比，新一代測序技術(shù)可以更快，更便宜地對大量DNA進(jìn)行測序。例如，在2001年，對人類(lèi)基因組進(jìn)行測序的成本接近1億美元。但到了2015年只需要大約1000美元！
為什么快速廉價(jià)的測序很重要？對DNA序列進(jìn)行常規測序的能力為生物學(xué)研究和生物醫學(xué)應用開(kāi)辟了新的可能性。例如，低成本的測序是朝著(zhù)精準醫學(xué)邁出的一步，也就是說(shuō)，根據他或她基因組中的變異基因，可以針對個(gè)體差異量身定制個(gè)性化醫療方案。
圖三 測序成本比較
目前，第二代高通量測序技術(shù)以Roche公司的454平臺、ABI公司的SOLiD平臺和illumina公司的Solexa平臺為代表。454平臺采用了焦磷酸測序法，是首個(gè)被發(fā)明的商用二代測序儀。SOLiD平臺是由獨特的連接酶測序法發(fā)展而來(lái)，檢測過(guò)程中兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號，相當于一次能檢測兩個(gè)堿基，因此該方法也被稱(chēng)為兩堿基測序法。Solexa平臺是現在應用最廣泛的二代測序平臺，作為測序界的巨鱷，占據了全球70%以上的測序儀器市場(chǎng)份額。其測序原理是基于可逆性鏈終止物和橋式PCR等專(zhuān)有技術(shù)的邊合成邊測序法（SBS）。
第二代測序技術(shù)常用的應用包括小型全基因組測序（微生物和病毒）、靶向基因測序（基于擴增子、基因panel）、轉錄組測序（總RNA-Seq、mRNA-Seq和基因表達圖譜分析）、甲基化測序以及16S宏基因組測序等。
圖四 SBS流程
近幾年，隨著(zhù)關(guān)鍵性技術(shù)的突破和革命性的發(fā)明，誕生了第三代高通量測序技術(shù)。第三代測序技術(shù)也稱(chēng)為單分子測序技術(shù)，根據測序技術(shù)原理主要分為兩大陣營(yíng)：第一陣營(yíng)是單分子熒光測序技術(shù)，代表性技術(shù)為Pac Bio公司的SMRT技術(shù)。該技術(shù)為了實(shí)現實(shí)時(shí)測序，利用零模波導孔技術(shù)避免了反應體系中游離的熒光標記核苷酸產(chǎn)生的強大熒光背景，同時(shí)開(kāi)發(fā)出新的核苷酸熒光標記方法，將傳統的堿基熒光標記改為標記磷酸基團，使得標記物會(huì )在DNA合成過(guò)程中自動(dòng)脫落，大大提高了DNA聚合酶的活性和測序讀長(cháng)。第二陣營(yíng)為Oxford Nanopore Technologies公司的單分子納米孔測序技術(shù)。與以往的光信號檢測手段不同，該方法采用電信號檢測，不依賴(lài)DNA聚合酶，因此理論上能夠做到超長(cháng)的測序讀長(cháng)。
相比第二代測序，第三代測序最大特點(diǎn)是單分子測序，過(guò)程中不涉及PCR過(guò)程，因此能夠有效避免PCR擴增的偏向性和引入突變，缺失等系統性錯誤。另外，第三代測序還能直接對DNA進(jìn)行甲基化測序分析，不需要事先對基因組進(jìn)行Bisulfite處理。但是，目前第三代測序平臺仍存在一些不足，需進(jìn)一步改進(jìn)和完善，如測序成本和錯誤率較高等。
圖五 MinlON測序儀
單細胞測序
自2013年，《Nature Methods》將單細胞測序評為年度技術(shù)，單細胞測序逐漸成為熱點(diǎn)技術(shù)。為什么呢？一方面是因為測序成本大大降低，使得NGS已經(jīng)成為實(shí)驗室里的家常便飯。另一方面，細胞作為生命結構和功能的基本單位，以往的測序樣品往往是組織樣本或細胞群，檢測結果是多個(gè)細胞的平均值，很容易掩蓋了異質(zhì)性細胞的信息。單細胞水平測序能夠使測序結果更加全面，多層次，復雜程度更高。
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，單細胞測序就是在測序前增加一步單細胞分離和標記的過(guò)程，常用的分離技術(shù)包括激光捕獲顯微切割、流式細胞分選、微孔捕獲技術(shù)和微流控技術(shù)等。目前，單細胞測序主要應用于空間基因表達、單細胞染色質(zhì)轉座酶可接近性分析（ATAC）、單細胞免疫分析和單細胞基因表達等。通過(guò)以上應用我們可以探索細胞間異質(zhì)性，鑒定新的靶點(diǎn)和生物標志物，分析配對的全長(cháng)B細胞或T細胞受體、抗原特異性、細胞表面蛋白表達和染色質(zhì)開(kāi)放性等。
圖六 10× Genomics的Chromium技術(shù)
小結
目前，NGS已經(jīng)被廣泛的應用于臨床醫學(xué)和基礎研究中，作為破解生命遺傳信息的重要手段，測序技術(shù)還在飛快的發(fā)展進(jìn)化。相信在未來(lái)，測序技術(shù)能夠幫助我們更全面的，更深層次的理解生命中的各種奧秘和疾病，甚至幫助我們攻克癌癥。
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