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作者：香雪精準醫療-羅朝權
發(fā)布時(shí)間：2019-12-09
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質(zhì)譜(massspeetrometr，MS)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)和生物大分子研究領(lǐng)域里的重要工具[1]。質(zhì)譜不僅可以精確得到蛋白質(zhì)的分子量，而且可以直接進(jìn)行測序。質(zhì)譜高效、不受末端是否封閉及是否經(jīng)過(guò)翻譯后修飾等的限制，隨著(zhù)分離技術(shù)的發(fā)展，液相質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)不斷提高，高通量分析抗原表位成為可能，因此在抗原表位研究中應用越來(lái)越多。
一 質(zhì)譜技術(shù)的原理
質(zhì)譜是一種將化學(xué)物質(zhì)發(fā)生離子化后，通過(guò)離子的質(zhì)荷比來(lái)分析的技術(shù)。質(zhì)譜組成主要包括進(jìn)樣系統、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器以及分析系統。上世紀八十年代，液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)解決了蛋白質(zhì)等生物大分子同分異構體的問(wèn)題，同時(shí)提高大分子化合物的離子化效率。隨著(zhù)納升流量技術(shù)的引入，使離子源的流速達到納升/分鐘，解決因樣品含量少而無(wú)法檢測的問(wèn)題，同時(shí)也提高了檢測靈敏度和檢測限（飛摩爾/微升）。復合式質(zhì)譜即是把兩種不同的質(zhì)量分析器串聯(lián)起來(lái)使用，也就是MS/MS系統，例如：Q-TOF和QE等，它具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。第一個(gè)質(zhì)量分析器進(jìn)行母離子的選擇，第二個(gè)質(zhì)量分析器進(jìn)行片段化碎裂后的子離子選擇。適合腫瘤細胞中MHC-I遞呈肽這類(lèi)極少量的樣品來(lái)獲得高質(zhì)量的譜圖。
二 質(zhì)譜在氨基酸測序的應用
在鑒定新的肽和蛋白質(zhì)、合成蛋白及從蛋白質(zhì)酶解液中分離出的肽時(shí)，準確確定氨基酸序列的信息是非常重要。而質(zhì)譜技術(shù)已成為氨基酸測序的有效工具。在ESI/MS中，首先在一級質(zhì)譜得到目標肽的分子離子，然后選取目標肽的離子作為母離子，與氬氣或者氦氣發(fā)生碰撞，使肽鏈中的肽鍵發(fā)生斷裂，形成一系列子離子，即N端碎片離子系列(b系列)和C端碎片離子系列(y系列)，對碎片離子系列綜合分析并給予評分，最終得到肽段的氨基酸序列。由于亮氨酸與異亮氨酸分子量相同，無(wú)法區分。Ramsey等通過(guò)負離子質(zhì)譜跟蹤由亮氨酸和異亮氨酸衍生出的乙內酰苯基硫脲的[M-H]-離子，根據亮氨酸主要顯示丙基的丟失，而異亮氨酸衍生物則顯示甲基和乙基的丟失這一特性，成功區別肽鏈中亮氨酸和異亮氨酸。
三 質(zhì)譜法在抗原表位研究中的應用
近代免疫學(xué)研究發(fā)現,一個(gè)病原體起免疫功能的主要是抗原蛋白，其中起決定作用的又是抗原蛋白上的抗原決定簇，即抗原表位。抗原表位可以分為T(mén)細胞表位和B細胞表位。T細胞表位是抗原經(jīng)過(guò)抗原遞呈細胞加工后，由HLA分子遞呈給T細胞抗原受體TCR的短肽。抗體識別的抗原決定簇稱(chēng)為B細胞表位。T細胞表位又可分為內源性抗原細胞表位和外源性抗原細胞表位。內源性抗原細胞表位來(lái)源于胞內抗原,與HLA-I類(lèi)分子結合,運送到細胞膜上，再與CDS+T細胞上TCR結合，介導T細胞免疫應答。而外源性抗原T細胞表位多來(lái)自于細胞外抗原，先結合到HLA-H類(lèi)分子凹槽中,然后再運送到膜上，由HLA-H類(lèi)分子遞呈給CD4-Th細胞，激活Th細胞輔助B細胞產(chǎn)生抗體，并介導NK細胞等免疫細胞產(chǎn)生細胞免疫應答[2]。質(zhì)譜法在上述抗原表位研究中均有重要應用。
1992年，質(zhì)譜首次被應用于HLA-I類(lèi)分子表位研究，Hunt等[3]通過(guò)酸洗方法在轉染了HLA-A2分子的人淋巴母細胞系CIR-A2.1中分離出抗原表位，使用毛細管電泳色譜串聯(lián)質(zhì)譜(NanoLC-MS/MS)，準確鑒定抗原肽的分子量以及氨基酸序列。由于CIR細胞系自身是不會(huì )不表達HLA類(lèi)分子，因此，從轉染了HLA-2A分子的CIR-A2.1中分離的抗原肽均為HLA-A2遞呈的抗原肽。
隨著(zhù)人們對于Th細胞功能認識的不斷深化，HLA-II類(lèi)分子遞呈的抗原肽研究越來(lái)越被人們重視。Chicz等[4]將質(zhì)譜技術(shù)應用于II類(lèi)表位研究，成功地分離出25個(gè)HLA-DRI遞呈的抗原肽，以及得到5條抗原肽的準確序列，其中有4條為外源性蛋白，僅僅一條為內源性蛋白。
綜上所述，質(zhì)譜技術(shù)現今已成為抗原表位研究領(lǐng)域必不可少的工具。隨著(zhù)質(zhì)譜新技術(shù)的不斷發(fā)展,質(zhì)譜檢測靈敏度以及檢測限將不斷提高，蛋白質(zhì)測序長(cháng)度也將不斷延長(cháng)，這一切必將會(huì )在抗原表位研究領(lǐng)域乃至在整個(gè)蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。
參考文獻 [1]McLafferty F W,Fridriksson E K,Horn D M,Lewis M A,Zubarev R A. Techview: biochemistry. Biomolecule mass spectrometry.[J]. Science,1999,284(5418). [2]郭愛(ài)林. 肝癌抗原肽的分離、純化、鑒定及抗原肽疫苗的研究[D].第四軍醫大學(xué),2001. [3] Hunt DF,Henderson R,Shabanowitz J. Characterization of peptides bound to the class I MHC molecule HLA-A2.1 by mass spectrometry.[J]. Science,1992,255(5049):1261. [4] Chicz, R. M. et al. Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DR1 are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size[J]. Nature,358(6389), 764-768
