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       腫瘤免疫學(xué)是生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展極為迅速的一個(gè)分支，其研究?jì)热萆婕埃耗[瘤抗原及其免疫原性；腫瘤發(fā)生、發(fā)展與免疫的關(guān)系；應用免疫學(xué)原理和方法對腫瘤進(jìn)行診斷、治療和預防。近年來(lái)，腫瘤免疫治療的研究也取得了很大的進(jìn)展，在這些研究中CTL的定性和定量檢測非常重要，因此如何更好地檢測CTL的生物活性及殺傷效應成為一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題。故許多新的評估CTL活性的方法也同時(shí)得到發(fā)展，本文就此進(jìn)行綜述。

 

1.     酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（ELISA）

 

      ELISA是一種基于酶的免疫測定方法，由于酶標的放大作用，利用酶標記抗體的免疫檢測，因其高特異性和敏感性而日益受到人們的青睞。

 

      細胞因子夾心ELISA是一種敏感的酶免疫分析方法，可以特異性地檢測和定量可溶性細胞因子和趨化因子蛋白的濃度。這一方法的基本原理是：①將已知抗體結合到某種固相載體表面；②加待測抗原，如兩者是特異的，則發(fā)生結合，然后把多余抗體洗除；③加入與待測抗原呈特異反應的酶聯(lián)抗體，使形成“夾心”；④加入該酶的底物，若看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生，說(shuō)明在孔壁上存在相應的抗原，利用酶標儀測其OD值。有色產(chǎn)物的量與待測抗原的量直接相關(guān)，故可根據顏色反應的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

 

      其局限性：①ELISA數據不能提供單個(gè)細胞產(chǎn)生因子的能力和頻率；②因受刺激細胞群的細胞因子產(chǎn)生是短暫的，并且不同細胞因子基因的表達動(dòng)力學(xué)可以變化，故可能需要在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集測試樣品以更好地表征實(shí)驗動(dòng)物或培養細胞群的細胞因子產(chǎn)生。③在任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量的細胞因子蛋白濃度可能反映細胞因子分泌，細胞因子攝取的并發(fā)過(guò)程。通過(guò)細胞和細胞因子蛋白降解。由于這些過(guò)程，測量的細胞因子蛋白水平可能顯著(zhù)低估細胞的實(shí)際細胞因子產(chǎn)生潛力。④試劑不統一，標準不統一，故定量不準確等。

 

2.     酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）

 

      ELISPOT是檢測和計數體外分泌特定蛋白質(zhì)的單個(gè)細胞的有力工具。該方法可通過(guò)檢測某些細胞因子的分泌水平評估抗原免疫后機體的細胞免疫應答能力，具有較高的敏感性和高效性。其基本原理是：①細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。②被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。③底物孵育后，PVDF孔板出現“紫紅色”的斑點(diǎn)表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過(guò)ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統對斑點(diǎn)分析后得出結果。

 

      ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：ELISA通過(guò)顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線(xiàn)比較得出定量的可溶性蛋白總量。ELISPOT通過(guò)顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接通過(guò)ELISPOT分析系統對斑點(diǎn)進(jìn)行計數，從而計算出分泌該蛋白或者細胞因子的細胞的頻率。由于是單細胞水平檢測，需細胞量少， 比ELISA更靈敏。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時(shí)，不會(huì )影響活化細胞分泌細胞因子。但該方法對于操作者的技術(shù)要求較高，要保證孔中細胞的均勻性，否則讀板誤差會(huì )很大。

3.     ⁵¹Cr釋放法

 

      ⁵¹Cr釋放法創(chuàng )建于1960年，是測定細胞殺傷功能最經(jīng)典的方法，其原理為：鉻酸鈉（Na2⁵¹CrO4）能進(jìn)入到增殖的細胞內，與細胞漿蛋白質(zhì)牢固地結合。當標記的⁵¹Cr細胞受到損傷或死亡之后，即可釋放出⁵¹Cr。⁵¹Cr輻射γ射線(xiàn)，通過(guò)測定受損傷或死亡靶細胞釋放到上清中的⁵¹Cr，即可計算出細胞的殺傷能力。但其有很多不足：①⁵¹Cr有放射性，不利于安全操作，且自釋放較高；②⁵¹Cr半衰期短，不能進(jìn)行多次測定；③定性分析，無(wú)法定量④不能在單細胞水平測定等。

 

4.     LDH釋放法

 

       LDH釋放法是基于比色法的檢測方法。乳酸脫氫酶(LDH)是活細胞胞漿內含酶之一，在正常情況下，不能透過(guò)細胞膜。當靶細胞受到效應細胞的攻擊而損傷時(shí)，細胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質(zhì)中，所以細胞死亡數量與細胞培養上清中LDH活性成正比。其原理為：釋放出的LDH在培養基上清中，可通過(guò) 30分鐘偶聯(lián)的酶反應來(lái)檢測，在酶反應中LDH可使一種四唑鹽（INT）轉化為紅色的甲臜。生成的紅色產(chǎn)物的量與裂解的細胞數成正比。利用酶標儀測其OD值，經(jīng)過(guò)計算即可得出細胞活性。此方法的缺點(diǎn)是效應細胞作用于靶細胞后會(huì )有不同程度的細胞損傷，進(jìn)而釋放ＬＤＨ，ＬＤＨ可能存在部分自發(fā)釋放現象，都會(huì )影響到細胞活性毒性檢測，故其對細胞狀態(tài)要求較高。

 

5.     基因轉染法

 

       應用基因轉染技術(shù)將原核或真核生物的報告酶如β-半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-gal)或熒光素酶(luciferase, luc)基因轉染靶細胞，建立穩定轉染靶細胞系, 以此測定CTL介導的細胞毒和細胞凋亡。通過(guò)測定釋放入培養液中報告酶活性(代表靶細胞死亡數目), 便可計算出效應細胞殺傷靶細胞百分率。在實(shí)驗中因β-gal半衰期較luc長(cháng), 故實(shí)際應用較多。本法優(yōu)點(diǎn)在于:①靈敏度高, 自發(fā)釋放背景低；②用不同報告基因轉染的細胞系可同時(shí)測定殺傷效應, 結果互不干擾；③用不同的基因調控元件(如組織特異性的或活性可誘導的啟動(dòng)子)控制報告基因的表達，可進(jìn)一步進(jìn)行深入機制研究。其主要不足是建立報告基因穩定轉染細胞系費時(shí)費力，報告基因在有些靶細胞中難以轉染或表達。

 

6.     熒光測定法

 

       熒光測定法 如Alamar-Blue一步熒光測定法、Calcein-am熒光掃描測定法等。這些測定所基于的原理都與⁵¹Cr釋放實(shí)驗基本相同，即將標記物質(zhì)滲入到靶細胞內, CTL殺傷靶細胞后, 檢測這些物質(zhì)釋放到培養基內的水平。雖然隨著(zhù)熒光測定儀器的普及和新的熒光標記物的發(fā)現，熒光測定法將有可能取代傳統的⁵¹Cr釋放法, 但由于熒光測定法基于的原理近似于⁵¹Cr釋放法, 所以都不能從本質(zhì)上解決不同靶細胞標記效率不同、CTL殺傷活性的檢測不夠敏感等問(wèn)題

 

7.     IncuCyte

 

      以上介紹的所有檢測方法都采用的是傳統的終點(diǎn)法，這種方法無(wú)法對CTL殺傷過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)的監測并進(jìn)行定量分析。美國Essen公司開(kāi)發(fā)了一款非標記的，長(cháng)時(shí)間動(dòng)態(tài)活細胞成像分析儀（IncuCyte）。 這一分析儀能實(shí)現對CTL殺傷過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)的監測并進(jìn)行定量分析。其原理與用的染料有關(guān)，總體分為兩種：一種為活細胞染料，一種為死細胞染料。

 

      目前常用的活細胞染料有IncuCyte NucLight（一種細胞滲透性DNA染料，專(zhuān)一性染活細胞的細胞核，當加入組織培養基后，該惰性染料穿過(guò)細胞膜，特異性染色DNA，然后就可用活細胞成像方法監控IncuCyte NucLight特異性染色DNA熒光的變化，發(fā)生實(shí)時(shí)活化的圖像，用IncuCyte分析儀進(jìn)行定量。）

 

      死細胞染料有IncuCyte Caspase-3/7（將活化的caspase-3/7識別部位（DEVD）和一種DNA嵌入染料NucView 633相偶聯(lián)，當該試劑加入組織培養基后，這種惰性的，無(wú)熒光的底物穿過(guò)細胞膜，在膜上被活化的caspase-3/7切開(kāi)，釋放出DNA染料，將細胞核里的DNA染上熒光。然后就可用活細胞成像方法監控caspase-3/7發(fā)生實(shí)時(shí)活化的圖像，用IncuCyte分析儀進(jìn)行定量。）IncuCyte Annexin V（一種高度選擇性的磷脂酰絲氨酸（PS）花箐熒光染料，當細胞發(fā)生凋亡時(shí)，細胞質(zhì)膜的磷脂酰絲氨酸（PS）的不對稱(chēng)性消失，PS顯露在細胞外表面，該試劑就與之相結合，發(fā)出明亮的光穩定的熒光信號。應用IncuCyte內置的分析軟件，可以定量發(fā)出熒光的凋亡細胞，也可以最小化背景熒光值。）YOYO-3，IncuCyte細胞毒性試劑等

 

      其優(yōu)點(diǎn)是：①培養的細胞用顯微鏡直接監測，為非破壞性的監測；②監測過(guò)程中細胞無(wú)需離開(kāi)培養箱，不用擔心培養條件的改變對細胞狀態(tài)的影響；③可在實(shí)驗室外對細胞進(jìn)行長(cháng)時(shí)間監測等。此方法也存在不可忽視的弊端，即不同的靶細胞生長(cháng)速度及形態(tài)大小不同，若要同時(shí)進(jìn)行多種靶細胞的檢測，便需要對所檢測靶細胞進(jìn)行預實(shí)驗，從而選出最佳種板靶細胞數。

 

      以上介紹的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）生物活性及殺傷效應的檢測方法應該是目前比較成熟且應用較多的技術(shù)。還有很多檢測方法在這里沒(méi)有介紹的，如流式細胞術(shù)及基于物理壓力原理的檢測儀器等，如果有興趣可自行查閱。